Статьи. Наука и практика.
АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ SACCHARINA JAPONICA IN VIVO
О.А. Шокур1, Н.В. Сергеева2, К.Е. Макарова1
1) Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток
2) Медицинское объединение ДВО РАН, г. Владивосток
В экспериментах на крысах оценивали антикоагулянтную, антиагрегантную активность фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica. Фукоидан вводили внутривенно в дозах 0,31, 1,25 и 2,5 мг/кг за 15-20 мин до забора крови. В плазме крови определяли активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время и количество фибриногена, агрегацию и количество тромбоцитов. Фукоидан оказывал дозозависимый антикоагулянтный эффект. Наиболее чувствительными оказались тесты по тромбиновому времени и активированному частичному тромбопластиновому времени. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг тест тромбинового времени увеличивался в 1,74 раза, а тест по актовированному частичному тромбопластиновому времени – в 3,24 раза по сравнению с контролем (p < 0.05). Фукоидан в дозе 1,25 мг/кг снижал агрегацию тромбоцитов на 14,4%, а время наступления дезагрегации на 11,2%, в дозе 2,5 мг/кг – на 27,3% и 29%, соответственно (p < 0,05).
Загрязнение окружающей среды считается основным фактором в развитии сердечнососудистых заболеваний [3]. На фоне экологического неблагополучия отмечается тенденция к увеличению частоты сердечнососудистых нарушений. Возрастающая потребность в антитромботической терапии указывает на необходимость поиска новых источников антикоагулянтных и антиагрегантных веществ. Перспективными соединениями для исследований в этой области являются фукоиданы, представляющие собой гетерогенный класс фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов, локализованных во внеклеточном матриксе бурых водорослей, в яйцевых оболочках морских ежей и стенке тела кукумарий [7]. Фукоиданы оказывают разнообразные биологические эффекты, включающие противовоспалительную [7], антиоксидантную [10], противоопухолевую [7], противовирусную [8], антикоагулянтную и антитромботическую [10, 11] активности, а также гастропротективные, гепатопротективные [6] и нефропротективные свойства [9]. Показано, что фукоиданы влияют на агрегацию тромбоцитов, процесс, который вовлечен в тромбообразование [2]. В настоящей работе мы исследовали эффекты фукоидана из бурой морской водоросли Saccharina japonica на гемостаз крови крыс.
Материал и методика. Бурую морскую водоросль Saccharina japonica (Laminaria japonica) собирали в б. Восток зал. Петра Великого (Японское море) в 2010 г. Фукоидан выделяли методом, в основе которого лежала экстракция раствором соляной кислоты [2]. Эксперименты выполняли на 60 крысах-самцах, массой 300-350 гр., получавших стандартную виварную диету. Перед введением исследуемых препаратов крыс наркотизировали золетилом (11,4 мг/кг) и ксилазином гидрохлоридом (9,1 мг/кг). Фукоидан вводили внутривенно в дозах 0,31, 1,25 и 2,5 мг/кг, а в качестве препаратов сравнения использовали антиагрегант диклофенак («Hemofarm», Сербия) в дозах 1,25, 2,5 мг/кг и прямой антикоагулянт гепарин («Московский эндокринный завод», Россия) в дозах 0,67, 1,15, 2,4 и 4,8 мг/кг. Контрольным животным вводили изотонический раствор натрия хлорида.
Кровь для исследования получали пункцией сердца через 15-20 мин после внутривенного введения исследуемых веществ, стабилизировав 3% раствором цитрата натрия в соотношении антикоагулянта и крови 1:9 [1], и центрифугировали при 200 g в течение 20 мин. для получения богатой тромбоцитами плазмы. Верхний слой плазмы аккуратно отбирали, оставшуюся часть пробы центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15 мин. для получения бестромбоцитарной плазмы. Агрегацию тромбоцитов изучали турбометрическим методом по Борну (Born G.V.R. 1962) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ «БИОЛА») [4]. В качестве индуктора агрегации использовали раствор АДФ в конечной концентрации 5 мкМ. Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы и времени наступления дезагрегации. О коагуляционном звене гемостаза судили по активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ), протромбиновому времени (ПВ), тромбиновому времени (ТВ) и концентрации фибриногена. Количество тромбоцитов подсчитыва ли микроскопическим методом в камере Горяева. Статистическую обработку количественных дан ных проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты. Фукоидан оказывал достоверный дозозависимый антикоагулянтный эффект. Фукоидан в концентрации 0,31 мг/кг удлинял АЧТВ в 1,66 раза по сравнению с контролем, в концентрации 1,25 мг/кг – в 3,24 раза, а в дозе 2,5 мг/кг – в 3,6 раз (p < 0,05). Фукоидан в концентрации 1,25 мг/кг увеличивал тест тромбинового времени в 1,74 раза, а в дозе 2,5 мг/кг не вызывал свертываемости плазмы. Концентрация фибриногена в плазме не изменялась при всех исследуемых дозах (табл. 1).
Таблица 1. Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения на коагуляцию крови у крыс
Вещество, концентрация мг/кг |
ПВ, с | АЧТВ, с | ТВ, с | Фибриноген, мг/л |
---|---|---|---|---|
физраствор (контроль) |
20,51 (18,23; 24,25) |
17,05 (15,98; 18,98) |
40,3 (38,65; 42,78) |
1,4 (1,1; 1,74) |
фукоидан, 0,31 | 22,7 (22,1; 23,3) |
28,30* (26,6; 29,9) |
40,0 (34; 54,2) |
1,74 (1,4; 1,76) |
фукоидан, 1,25 | 27,7 (16,9; 29,6) |
55,30* (25,8; 92,5) |
70,3* (57,45; 100) |
1,49 (0,96; 2,74) |
фукоидан, 2,5 | >100* | 60,95* (21,63; 100) |
>100* | 1,2 (1,1; 2,76) |
гепарин, 0,67 | 15,7* (15,3; 17) |
14,5* (14,2; 14,7) |
39,4 (38,9; 39,8) |
0,52 (0,5; 0,55)* |
гепарин, 1,15 | 25,7 (19,75; 30,33) |
58,9* (17,3; 100) |
>100* | 0* |
гепарин, 2,4 | 13,4* (12,9; 13,9) |
>100* | >100* | 0* |
гепарин, 4,8 | >100* | >100* | >100* | 0* |
диклофенак, 1,25 | 21,0 (20,2; 21,7) |
17,50 (17,1; 17,9) |
45,4* (43,4; 47,4) |
1,02 (0,72; 1,71) |
диклофенак, 2,5 | 19,75 (15,18; 22,25) |
16,05 (15,38;19,05) |
38,60 (36,25; 44,25) |
1,28 (0,98; 1,64) |
Примечание: >100 – отсутствие свертываемости плазмы более 100 сек; *- достоверное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапа- зона (25%; 75%).
Фукоидан уменьшал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов дозозависимо. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг агрегация тромбоцитов снижалась на 14,4%, а в концентрации 2,5 мг/кг – на 27,3%. Фукоидан в дозе 1,25 и 2,5 мг/кг сокращал время наступления дезагрегации на 11,2 и 29%, соответственно. Антиагрегантный эффект полисахарида был сопоставим с активностью диклофенака (табл. 2). В группе животных, которым вводили фукоидан в дозе 2,5 мг/кг, количество тромбоцитов периферической крови уменьшилось на 23% по сравнению с контрольной группой (p=0,0428). Однако изменение данного показателя в группе фукоидана было меньше, чем в группе животных, которым вводили гепарин (рис. 1).
Таблица 2. Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов у крыс
Препарат, доза | Время наступления дезагрегации, с | Максимальная сте- пень агрегации, % |
---|---|---|
физ. раствор (контроль) | 241 (217, 322) | 44 (38,6; 47,55) |
фукоидан 1,25 мг/кг | 214 (167,5; 223)* | 37,65 (30,08; 40,35)* |
фукоидан 2,5 мг/кг | 171 (150; 192)* | 32 (28,8; 35,9)* |
диклофенак 2,4 мг/кг | 204,5 (181,5; 225,8)* | 38,6 (28; 40,5)* |
гепарин 2,4 мг/кг | 275 (199; 311) | 36,2 (30,25; 41,8) |
Примечание: *- достоверное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%)
Рис. 1. Влияние исследуемых веществ на количество тромбоцитов в периферической крови крыс
Выводы: фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japonica, влияет на гемостаз крови крыс. В низких дозах фукоидан ингибирует внутренний путь свертывания крови, а при увеличении вводимой дозы ингибирует и внешний, и внутренний пути гемостаза. Удлинение теста тромбинового времени под действием фукоидана свидетельствует о способности полисахарида влиять на завершающий этап процесса свертывания. Проведенные исследования показали, что степень антикоагулянтной активности фукоидана может быть сопоставима с таковой у гепарина. В то же время фукоидан, в отличие от гепарина, лишен такого побочного эффекта, как тромбоцитопения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Закревская, A.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации // Патологическая физиология системы гемостаза / под ред. Н.Н. Петрищева. – Л.: 1990. С. 46-54.
2. Шокур, О.А. Влияние фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли Saccharina japonica, на агрегацию тромбоцитов in vitro / О.А. Шокур, Ю.С. Хотимченко // Биология моря. 2013. Т. 39. № 5. C. 380-383.
3. Bhatnagar, A. Environmental cardiology: studying mechanistic links between pollution and heart disease // Circ Res. 2006. V. 99(7). P. 692-705.
4. Born, G.V.R. Quantitative investigation into the aggregation of blood platelets // J. Physiol. 1962. Vol. 162. P. 67-68.
5. Cumashi, A. A comparative study of the antiinflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds / A. Cumashi, N.A. Ushakova, M.E.A. Preobrazhenskaya // Glycobiology. 2007. V. 17 P. 541-552.
6. Hayakawa, K. Effect of fucoidan on the biotinidase kinetics in human hepatocellular carcinoma / K. Hayakawa, T. Nagamine // Anticancer Res. 2009. V. 4. P. 1211-1217.
7. Khotimchenko, Y.S. Antitumor properties of nonstarch polysaccharides: Fucoidans and chitosans // Russ. J. Mar. Biol. 2010. V. 36. P. 321-330.
8. Makarenkova, I.D. Antiviral activity of sulfated polysaccharide from the brown algae Laminaria japonica against avian influenza A (H5N1) virus infection in the cultured cells / I.D. Makarenkova, P.G. Deriabin, D.K. L’vov et al. // Vopr. Virusol. 2010. V. 55. P. 41-45.
9. Veena, C.K. Renal peroxidative changes mediated by oxalate: The protective role of fucoidan / C.K. Veena, A. Josephine, S.P. Preetha et al. / Life Sci. 2006. V. 79. P. 1789-1795.
10. Wang, J. Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica / J. Wang, Q.B. Zhang, Z.S. Zhang // Int. J. Biol. Macromol. 2010. V. 46. P. 6-12.
11. Zhu, Z. Higher specificity of the activity of low molecular weight fucoidan for thrombin-induced platelet aggregation / Z. Zhu, Q. Zhang, L. Chen et al. // Thrombosis Research. 2010. V. 125 P. 419-426.