О.А. Шокур1, Н.В. Сергеева2, К.Е. Макарова1
1) Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток
2) Медицинское объединение ДВО РАН, г. Владивосток
В экспериментах на крысах оценивали антикоагулянтную, антиагрегантную активность фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica. Фукоидан вводили внутривенно в дозах 0,31, 1,25 и 2,5 мг/кг за 15-20 мин до забора крови. В плазме крови определяли активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время и количество фибриногена, агрегацию и количество тромбоцитов. Фукоидан оказывал дозозависимый антикоагулянтный эффект. Наиболее чувствительными оказались тесты по тромбиновому времени и активированному частичному тромбопластиновому времени. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг тест тромбинового времени увеличивался в 1,74 раза, а тест по актовированному частичному тромбопластиновому времени – в 3,24 раза по сравнению с контролем (p < 0.05). Фукоидан в дозе 1,25 мг/кг снижал агрегацию тромбоцитов на 14,4%, а время наступления дезагрегации на 11,2%, в дозе 2,5 мг/кг – на 27,3% и 29%, соответственно (p < 0,05).
Загрязнение окружающей среды считается основным фактором в развитии сердечнососудистых заболеваний [3]. На фоне экологического неблагополучия отмечается тенденция к увеличению частоты сердечнососудистых нарушений. Возрастающая потребность в антитромботической терапии указывает на необходимость поиска новых источников антикоагулянтных и антиагрегантных веществ. Перспективными соединениями для исследований в этой области являются фукоиданы, представляющие собой гетерогенный класс фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов, локализованных во внеклеточном матриксе бурых водорослей, в яйцевых оболочках морских ежей и стенке тела кукумарий [7]. Фукоиданы оказывают разнообразные биологические эффекты, включающие противовоспалительную [7], антиоксидантную [10], противоопухолевую [7], противовирусную [8], антикоагулянтную и антитромботическую [10, 11] активности, а также гастропротективные, гепатопротективные [6] и нефропротективные свойства [9]. Показано, что фукоиданы влияют на агрегацию тромбоцитов, процесс, который вовлечен в тромбообразование [2]. В настоящей работе мы исследовали эффекты фукоидана из бурой морской водоросли Saccharina japonica на гемостаз крови крыс.
Материал и методика. Бурую морскую водоросль Saccharina japonica (Laminaria japonica) собирали в б. Восток зал. Петра Великого (Японское море) в 2010 г. Фукоидан выделяли методом, в основе которого лежала экстракция раствором соляной кислоты [2]. Эксперименты выполняли на 60 крысах-самцах, массой 300-350 гр., получавших стандартную виварную диету. Перед введением исследуемых препаратов крыс наркотизировали золетилом (11,4 мг/кг) и ксилазином гидрохлоридом (9,1 мг/кг). Фукоидан вводили внутривенно в дозах 0,31, 1,25 и 2,5 мг/кг, а в качестве препаратов сравнения использовали антиагрегант диклофенак («Hemofarm», Сербия) в дозах 1,25, 2,5 мг/кг и прямой антикоагулянт гепарин («Московский эндокринный завод», Россия) в дозах 0,67, 1,15, 2,4 и 4,8 мг/кг. Контрольным животным вводили изотонический раствор натрия хлорида.
Кровь для исследования получали пункцией сердца через 15-20 мин после внутривенного введения исследуемых веществ, стабилизировав 3% раствором цитрата натрия в соотношении антикоагулянта и крови 1:9 [1], и центрифугировали при 200 g в течение 20 мин. для получения богатой тромбоцитами плазмы. Верхний слой плазмы аккуратно отбирали, оставшуюся часть пробы центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15 мин. для получения бестромбоцитарной плазмы. Агрегацию тромбоцитов изучали турбометрическим методом по Борну (Born G.V.R. 1962) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ «БИОЛА») [4]. В качестве индуктора агрегации использовали раствор АДФ в конечной концентрации 5 мкМ. Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы и времени наступления дезагрегации. О коагуляционном звене гемостаза судили по активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ), протромбиновому времени (ПВ), тромбиновому времени (ТВ) и концентрации фибриногена. Количество тромбоцитов подсчитыва ли микроскопическим методом в камере Горяева. Статистическую обработку количественных дан ных проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты. Фукоидан оказывал достоверный дозозависимый антикоагулянтный эффект. Фукоидан в концентрации 0,31 мг/кг удлинял АЧТВ в 1,66 раза по сравнению с контролем, в концентрации 1,25 мг/кг – в 3,24 раза, а в дозе 2,5 мг/кг – в 3,6 раз (p < 0,05). Фукоидан в концентрации 1,25 мг/кг увеличивал тест тромбинового времени в 1,74 раза, а в дозе 2,5 мг/кг не вызывал свертываемости плазмы. Концентрация фибриногена в плазме не изменялась при всех исследуемых дозах (табл. 1).
Таблица 1. Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения на коагуляцию крови у крыс
Вещество, концентрация мг/кг |
ПВ, с | АЧТВ, с | ТВ, с | Фибриноген, мг/л |
---|---|---|---|---|
физраствор (контроль) |
20,51 (18,23; 24,25) |
17,05 (15,98; 18,98) |
40,3 (38,65; 42,78) |
1,4 (1,1; 1,74) |
фукоидан, 0,31 | 22,7 (22,1; 23,3) |
28,30* (26,6; 29,9) |
40,0 (34; 54,2) |
1,74 (1,4; 1,76) |
фукоидан, 1,25 | 27,7 (16,9; 29,6) |
55,30* (25,8; 92,5) |
70,3* (57,45; 100) |
1,49 (0,96; 2,74) |
фукоидан, 2,5 | >100* | 60,95* (21,63; 100) |
>100* | 1,2 (1,1; 2,76) |
гепарин, 0,67 | 15,7* (15,3; 17) |
14,5* (14,2; 14,7) |
39,4 (38,9; 39,8) |
0,52 (0,5; 0,55)* |
гепарин, 1,15 | 25,7 (19,75; 30,33) |
58,9* (17,3; 100) |
>100* | 0* |
гепарин, 2,4 | 13,4* (12,9; 13,9) |
>100* | >100* | 0* |
гепарин, 4,8 | >100* | >100* | >100* | 0* |
диклофенак, 1,25 | 21,0 (20,2; 21,7) |
17,50 (17,1; 17,9) |
45,4* (43,4; 47,4) |
1,02 (0,72; 1,71) |
диклофенак, 2,5 | 19,75 (15,18; 22,25) |
16,05 (15,38;19,05) |
38,60 (36,25; 44,25) |
1,28 (0,98; 1,64) |
Примечание: >100 – отсутствие свертываемости плазмы более 100 сек; *- достоверное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапа- зона (25%; 75%).
Фукоидан уменьшал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов дозозависимо. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг агрегация тромбоцитов снижалась на 14,4%, а в концентрации 2,5 мг/кг – на 27,3%. Фукоидан в дозе 1,25 и 2,5 мг/кг сокращал время наступления дезагрегации на 11,2 и 29%, соответственно. Антиагрегантный эффект полисахарида был сопоставим с активностью диклофенака (табл. 2). В группе животных, которым вводили фукоидан в дозе 2,5 мг/кг, количество тромбоцитов периферической крови уменьшилось на 23% по сравнению с контрольной группой (p=0,0428). Однако изменение данного показателя в группе фукоидана было меньше, чем в группе животных, которым вводили гепарин (рис. 1).
Таблица 2. Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов у крыс
Препарат, доза | Время наступления дезагрегации, с | Максимальная сте- пень агрегации, % |
---|---|---|
физ. раствор (контроль) | 241 (217, 322) | 44 (38,6; 47,55) |
фукоидан 1,25 мг/кг | 214 (167,5; 223)* | 37,65 (30,08; 40,35)* |
фукоидан 2,5 мг/кг | 171 (150; 192)* | 32 (28,8; 35,9)* |
диклофенак 2,4 мг/кг | 204,5 (181,5; 225,8)* | 38,6 (28; 40,5)* |
гепарин 2,4 мг/кг | 275 (199; 311) | 36,2 (30,25; 41,8) |
Примечание: *- достоверное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%)
Рис. 1. Влияние исследуемых веществ на количество тромбоцитов в периферической крови крыс
Выводы: фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharina japonica, влияет на гемостаз крови крыс. В низких дозах фукоидан ингибирует внутренний путь свертывания крови, а при увеличении вводимой дозы ингибирует и внешний, и внутренний пути гемостаза. Удлинение теста тромбинового времени под действием фукоидана свидетельствует о способности полисахарида влиять на завершающий этап процесса свертывания. Проведенные исследования показали, что степень антикоагулянтной активности фукоидана может быть сопоставима с таковой у гепарина. В то же время фукоидан, в отличие от гепарина, лишен такого побочного эффекта, как тромбоцитопения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Закревская, A.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации // Патологическая физиология системы гемостаза / под ред. Н.Н. Петрищева. – Л.: 1990. С. 46-54.
2. Шокур, О.А. Влияние фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли Saccharina japonica, на агрегацию тромбоцитов in vitro / О.А. Шокур, Ю.С. Хотимченко // Биология моря. 2013. Т. 39. № 5. C. 380-383.
3. Bhatnagar, A. Environmental cardiology: studying mechanistic links between pollution and heart disease // Circ Res. 2006. V. 99(7). P. 692-705.
4. Born, G.V.R. Quantitative investigation into the aggregation of blood platelets // J. Physiol. 1962. Vol. 162. P. 67-68.
5. Cumashi, A. A comparative study of the antiinflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds / A. Cumashi, N.A. Ushakova, M.E.A. Preobrazhenskaya // Glycobiology. 2007. V. 17 P. 541-552.
6. Hayakawa, K. Effect of fucoidan on the biotinidase kinetics in human hepatocellular carcinoma / K. Hayakawa, T. Nagamine // Anticancer Res. 2009. V. 4. P. 1211-1217.
7. Khotimchenko, Y.S. Antitumor properties of nonstarch polysaccharides: Fucoidans and chitosans // Russ. J. Mar. Biol. 2010. V. 36. P. 321-330.
8. Makarenkova, I.D. Antiviral activity of sulfated polysaccharide from the brown algae Laminaria japonica against avian influenza A (H5N1) virus infection in the cultured cells / I.D. Makarenkova, P.G. Deriabin, D.K. L’vov et al. // Vopr. Virusol. 2010. V. 55. P. 41-45.
9. Veena, C.K. Renal peroxidative changes mediated by oxalate: The protective role of fucoidan / C.K. Veena, A. Josephine, S.P. Preetha et al. / Life Sci. 2006. V. 79. P. 1789-1795.
10. Wang, J. Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica / J. Wang, Q.B. Zhang, Z.S. Zhang // Int. J. Biol. Macromol. 2010. V. 46. P. 6-12.
11. Zhu, Z. Higher specificity of the activity of low molecular weight fucoidan for thrombin-induced platelet aggregation / Z. Zhu, Q. Zhang, L. Chen et al. // Thrombosis Research. 2010. V. 125 P. 419-426.